Спустя пару десятилетий после открытия систем, способных избирательно нацеливаться на ДНК, мы начинаем видеть первые методы лечения на основе редактирования генов. Одной из проблем, с которыми столкнулись эти разработки, является безопасность. Хотя мы можем сделать их довольно специфичными к нужному гену, геном человека очень велик, и даже редкие последовательности ДНК могут случайно встретиться несколько раз.
В результате все исходные системы редактирования генов имели известные показатели так называемых нецелевых эффектов, когда они просто редактируют неправильную последовательность. Это может быть маловероятным событием, но при редактировании достаточного количества клеток — а терапии обычно должны редактировать много клеток — ошибки становятся неизбежными.
Было приложено много усилий для поиска способов минимизировать или устранить нецелевые правки. В недавнем выпуске Nature исследователи описали модификацию AI-программы для сворачивания белков AlphaFold, чтобы помочь выявить ключевые области белков редактирования генов, ответственные за нецелевые эффекты. Затем эти области были модифицированы для уменьшения проблем.
Редактирование генов и нецелевые эффекты
Системы редактирования генов имеют три ключевых компонента. Первый — это направляющая РНК, которая может образовывать пары оснований с целевой последовательностью генома. Можно разработать множество направляющих РНК, нацеленных на один и тот же ген, поэтому один из подходов к повышению безопасности системы — выбирать последовательности, которые не имеют большого сходства с другими участками генома. Сейчас это широко используется как часть базового процесса проектирования системы редактирования генов.
Второй компонент — это белок Cas, названный в честь белка Cas9 системы CRISPR. Он взаимодействует как с направляющей РНК, так и с геномной РНК и помогает обеспечивать специфичность взаимодействий.
Если в спаривании оснований между РНК и ДНК слишком много несоответствий, Cas9 (или другие члены семейства Cas) не будет там удерживаться. Различные подходы привели к улучшенным членам семейства Cas, которые снизили склонность к нецелевым правкам.
Последний ключевой компонент системы — это белок, который взаимодействует с Cas9, когда тот связан с ДНК, и модифицирует ДНК. В исходной системе CRISPR он разрезал обе цепи двойной спирали, вызывая повреждения, которые трудно контролировать. С тех пор исследователи модифицировали другие белки для взаимодействия с Cas9, но катализирующие более тонкие изменения в ДНК, такие как отщепление одного основания или химические модификации, изменяющие то, как оно образует пары оснований.
В целом, длина спаривания оснований между направляющими РНК и геномом составляет порядка 18 оснований. Это должно встречаться в случайных последовательностях ДНК лишь примерно один раз на 70 миллиардов оснований, а наш геном составляет всего около 3 миллиардов оснований. По этой мерке, все должно быть хорошо. Но оказывается, что Cas9 может переносить небольшое количество неправильно спаренных оснований, не теряя способности связываться с ДНК. Точное количество и расположение оснований, где допускаются вариации, может несколько различаться, что затрудняет заблаговременное определение того, какие направляющие РНК могут представлять опасность.
Один из путей повышения безопасности — лучше понять, как происходят эти нецелевые взаимодействия.
Установление контакта
Команда, стоящая за новой работой, базирующаяся в различных учреждениях Китая, заранее продумала свой подход. Идеально совпадающий гибрид ДНК-РНК будет иметь одну структуру, а гибрид с одним или несколькими неправильно спаренными основаниями — немного другую. Эволюция оптимизировала структуру Cas9 для связывания с первой. Но, по-видимому, это не помешало Cas9 принимать слегка различные конформации, которые могут взаимодействовать с неправильно спаренными структурами.
Если мы сможем идентифицировать участки Cas9, которые опосредуют эти проблемные взаимодействия, мы сможем их модифицировать и потенциально блокировать.
Первым шагом команды было создание большой библиотеки сайтов нецелевого редактирования. Они сделали это, используя модифицированную систему CRISPR, которая преобразует основание ДНК аденин в родственное химическое вещество — инозин, а затем выделяя любые фрагменты ДНК, содержащие его. Они повторили этот процесс с 10 различными направляющими РНК и проанализировали большое количество модифицированных фрагментов ДНК от каждой, чтобы получить широкую картину типов присутствующих нецелевых последовательностей.
Следующим шагом было изучение того, как комплекс CRISPR взаимодействует с ними, с использованием AI-программы для сворачивания белков AlphaFold. Обновленные версии были разработаны для обработки взаимодействий между белками и нуклеиновыми кислотами, а также комплексов из нескольких белков. Поэтому команда подала в AlphaFold версии целевой последовательности ДНК вместе с направляющей РНК, последовательностью Cas9 и ферментом, который химически модифицирует основания и может прикрепляться к Cas9.
К сожалению, программа дала сбой, поместив один из белков в явно неправильное место.
Не обескураженная, команда упростила задачу и подала в AlphaFold только ДНК, РНК и белок Cas9, поскольку последний является основным фактором, определяющим его специфичность последовательности. Это сработало гораздо лучше, создав структуру, которая согласовывалась с теми, что были определены экспериментами с реальными нуклеиновыми кислотами и белками.
Сравнивая структуры, которые AlphaFold генерировал при подаче различных целевых и нецелевых сайтов, исследователи обнаружили общую закономерность. Многие (около двух третей) нецелевых сайтов заставляли белок Cas9 принимать слегка другую структуру. Но почти все (более 95 процентов) из них изменяли то, какие аминокислоты контактируют с РНК. Таким образом, есть явные случаи, когда Cas9 сохраняет свою нормальную структуру, но аминокислоты внутри него изгибаются таким образом, чтобы приспособиться к неправильно спаренным основаниям нецелевых сайтов.
Удобно, что AlphaFold уже был настроен на определение так называемой «вероятности контакта», а именно вероятности того, что любые два элемента, такие как аминокислоты или нуклеотиды, находятся на очень малом расстоянии (восемь ангстрем). Исследователи могли взять выходные данные анализа вероятности контакта для целевых и нецелевых сайтов и сравнить их, определив, какие именно аминокислоты в Cas9 имеют измененные контакты при несоответствии между направляющей РНК и ДНК. Они назвали эту компьютерную систему анализа «ContactSeek».
Лучшее нацеливание
Сам по себе ContactSeek, как правило, выдавал большой список аминокислот, которые смещаются при связывании с нецелевым сайтом. Поэтому исследователи сосредоточились на областях белка Cas9, где эти аминокислоты были сгруппированы, рассматривая это как признак того, что эти области адаптируются к различиям, вызванным несоответствием оснований. Затем они начали тестировать версии Cas9 с различными аминокислотами в этих сайтах.
В общей сложности исследователи сделали 23 различные замены, поместив другую аминокислоту в одну из 10 ключевых позиций, выявленных их работой с AlphaFold. Это позволило им найти вариант с активностью, аналогичной нормальному Cas9, на сайтах, соответствующих целевой последовательности, в то время как его нецелевая активность снизилась с 28 процентов до 5 процентов. Аналогичные результаты были возможны при использовании исследователями различных направляющих РНК. Они также показали, что подход работает для аналогичной системы, использующей другой белок Cas (Cas12) для распознавания комбинации ДНК/направляющая РНК.
Как упоминалось выше, другие исследовательские группы использовали различные подходы, такие как направленная эволюция, для разработки вариантов Cas9, менее склонных к нецелевому редактированию. При тестировании с этими вариантами недавно разработанные версии, как правило, демонстрировали аналогичную или даже немного лучшую активность и специфичность. Главное отличие здесь в том, что изменения, выявленные этим подходом, могут быть несколько более специфичными для данной комбинации направляющая РНК/несоответствие, а не более общими.
Конечно, некоторые из отдельных изменений, выявленных здесь, потенциально могут быть объединены с изменениями в ранее разработанных версиях Cas9 для еще большего улучшения, хотя это не было проверено здесь.
В любом случае, работа потенциально полезна, поскольку она описывает общий метод создания систем редактирования генов, адаптированных для предотвращения известных нецелевых событий. Если это окажется узким местом в разработке терапии, эта работа может стать значительным прорывом. Но исследователи также предполагают, что подход будет полезен в более общем плане для тонкой настройки взаимодействий белок-ДНК, что может найти применение далеко за пределами редактирования генов.
Nature, 2026. DOI: 10.1038/s41586-026-10794-z (О DOIs).
Всегда имейте в виду, что редакции могут придерживаться предвзятых взглядов в освещении новостей.
Автор – John Timmer
